مشخصات

عنوان: دستکاری ژنتیکی سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی با استفاده از سازه واریانت موتانت ژن CXCR4 به منظور بهبود خانه گزینی هدفمند آنها

گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  واحد استان خراسان رضوی 

گروه پژوهشی: سلولهای بنیادی و پزشکی ترمیمی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  فروردین 1395

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 8762000-8795530-0511

نشانی سازمان مجری: مشهد، میدان آزادی، صندوق پستی: 1376-91775
 

چکیده:

مقدمه: آخرین مطالعات نشان داده اند که سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی (Ad-MSC) می تواند آسیب بافت ایسکمیک را با اثرات پاراکرین و یا تمایز آنها به انواع سلول های ناحیه آسیب دیدگی کاهش می دهد، با این حال، خانه گزینی سلول های پیوندی بعد از تزریق سیستماتیک و یا تزریق در محل ضایعه، بسیار کم است و منجر به کاهش اثرات درمانی آن می شود. محور SDF1/CXCR4 به عنوان یک عامل بسیار مهم برای لانه گزین و پیوند سلول های بنیادی شناخته شده است. در این مطالعه، ما با افزایش واریانت طبیعی و موتانت ژن CXCR4 در سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی سعی در افزایش خانه گزینی و متعاقب آن بهبود مهاجرت سلولی داشته ایم.
مواد و روش ها: واریانت های طبیعی و موتانت ژن CXCR4 به صورت شیمیایی سنتز و در وکتور لنتی ویروسی pCDH-513b کلون شد. غلظت ذرات ویروسی تولید شده پس از ترنسفکشن سلول های HEK293 با توجه به روش Trono تعیین شد. سپس سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی با ویروس های تولید شده تراریخت شد. 72 ساعت پس از انتقال، سلول ها به مدت 3 روز با پیورومایسین تیمار شدند. پس از آن بیان CXCR4 در سطح mRNA و توانایی مهاجرت سلولهای تراریخت با استفاده از آزمون مهاجرت سلولی بررسی شد.
نتایج: شبیه سازی مولکولی ژن مصنوعی به وسیله تعیین توالی تایید شد. حضور سلول های بنیادی مزانشیمی GFP مثبت بهره وری بالا از انتقال را تایید کرد. نتایج qPCR در سلول های بنیادی مزانشیمی تراریخت شده بیان بیش از حد CXCR4 را نشان داد. سلول های بنیادی مزانشیمی اصلاح شده ژنتیکی به طور قابل توجهی افزایش مهاجرت در مقایسه با گروه کنترل (p<0.05) نشان دادند.
نتیجه گیری: افزایش بیان ژن جهش یافته CXCR4 باعث بهبود خانه گزینی سلول های بنیادی و مهاجرت سلولی می شود.



کلیدواژگان: سلول های بنیادی مزانشیمی، خانه گزینی، CXCR4، ترنسداکشن ویروسی، آزمون مهاجرت سلولی

 
 
Title: Genetic manipulation of human MSCs with a lentiviral construct carrying a mutant variant of CXCR4 gene in order to improve their homing capacity

Abstract:

Background: Recent studies have demonstrated that adipose-derived mesenchymal stem cells (MSCs) can attenuate ischemic tissue injury, possibly by their paracrine effects or differentiation into local cell types. However, homing of transplanted cells either transfused systematically or via direct intra-lesional injection, is reported to be very low and transient, leading to reduced therapeutic effects. CXCR4 is identified as a crucial factor for homing and engraftment of stem cells. In this study, we overexpressed CXCR4 in adipose-derived MSCs to enhance their level of engraftment and perhaps improve their translational effectiveness.
Materials and Methods: Wild type and WHIM-type variants of CXCR4 gene were chemically synthesized and cloned in pCDH-513b lentiviral vector. Viral particles were generated and their concentrations were determined according to Trono lab protocol after transfection of HEK293 cells. Adipose-derived mesenchymal stem cells in passage 3 and 4 were transduced with both variants of CXCR4. 72 h post transduction, cells were selected with puromycin for 3 days. Migration ability of transduced cells was then assessed by transwell chamber assay.
Results: Molecular cloning of the synthetic gene was confirmed by DNA sequencing. The presence of GFP positive MSCs confirmed the high efficiency of transduction. Our qPCR results showed overexpression of CXCR4 at mRNA level in transduced MSCs. Genetically modified MSCs (wild and WHIM types) had significantly enhanced migration capabilities in comparison with control group (p<0.05).
Conclusion: Overexpression of mutant CXCR4 resulted in improved homing of MSCs, which is very important in better success in cell therapy.



Keyword(s): MSCs, Homing, WHIM-type CXCR4, Genetic Modification, Viral Transfection, Transwell Migration Assay