مشخصات

عنوان: مطالعه فراساختار و بیان ژنهای بلوغ فولیکولی، رگزائی و آپوپتوزی بافت تخمدان موش صحرائی پس از انجماد شیشه ای و پیوند به خود

گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: جنین شناسی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  اردیبهشت 1395

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

هدف از مطالعه حاضر تعیین ترکیب ضد یخ مناسب برای انجماد شیشه ای بافت تخمدان کامل موش صحرایی و بررسی تغییرات هورمونی، فراساختار فولیکول ابتدایی، بیان ژنهای بلوغ فولیکولی، رگزائی و آپوپتوزی بافت تخمدان انجمادی پس از پیوند به خودی است.
برای قسمت اول مطالعه و به منظور تعیین ترکیب ضدیخ مناسب، تخمدان های موش های صحرایی ویستار 5 هفته ای به طور تصادفی به 13 گروه با عنوان کنترل (غیرانجمادی)، VI و TI (EG + DMSO)، VII و TII (EG + PROH)، VIII و TIII (DMSO + PROH)، VIV و EG+ DMSO) TIV و 0.25 مول در لیتر سوکروز)، VV و TV (EG + PROH) و 0.25 مول در لیتر سوکروز) و VVI و DMSO+ PROH) TVI و 0.25 مول در لیتر سوکروز) تقسیم بندی شده و با استفاده از روش های بافت شناسی معمولی، EM و ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفتند.

برای قسمت دوم مطالعه نیز پس از تعیین ترکیب ضدیخ مناسب و به منظور بررسی تغییرات پیوند به خودی بافت تخمدان انجمادی، تخمدان های موش با مشخصات فوق به صورت تصادفی در 6 گروه کنترل (غیر انجمادی غیر پیوندی)، nVTnG (غیر انجمادی پیوندی غیر گنادکتومی)، VTnG (انجمادی پیوندی غیر گنادکتومی)، nVTG (غیر انجمادی پیوندی گنادکتومی)، VTG (انجمادی پیوندی گنادکتومی) و BLG (گنادکتومی دو طرفه) تقسیم بندی شده و به مانند قسمت اول، با استفاده از روش های بافت شناسی معمولی، EM و ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفتند. علاوه بر آن در این گروه ها، بیان ژن های بلوغ فولیکولی، آپوپتوزی و رگ زایی با روش Real Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفته و سطح گنادوتروپین ها (LH وFSH (و هورمون های استروئیدی (استرادیول، پروژسترون و تستوسترون) در سرم خون با گروه کنترل و BLG (گنادکتومی دو طرفه) مقایسه شد.

نتایج نشان داد که گروه های انجمادی با ترکیبات مختلف ضدیخ در مقایسه با گروه کنترل، فولیکول های سالم کمتری داشته و درصد فولیکول های آپوپتوتیک آن ها بالاتر است. همچنین در بین گروه های انجمادی، گروه VIV بهترین میزان زنده مانی را به خصوص برای فولیکول های مراحل ابتدایی داشته و درصد بروز آپوپتوز آن کمتر بود. تغییرات فراساختاری در گروه اخیر در مقایسه با گروه کنترل محسوس بوده اما نسبت به گروه فاقد سوکروز (گروه (VI، چندان مزیتی را نشان نداد.
پیوند به خودی تخمدان های غیر انجمادی و انجمادی، بازگشت چرخه هورمونی و عملکرد تخمدان را به دنبال داشته و در دو گروه VTG و nVTG، به گروه کنترل نزدیک تر بود. همچنین در دو گروه اخیر، درصد بلوغ فولیکول ها و نیز فراساختار تخمدان پیوندی، وضعیت بهتری را نشان داده و بروز آپوپتوز در فولیکول های بدوی و آنترال نسبت به دو گروه nVTnG و VTnG بیشتر و در فولیکول های اولیه و پرآنترال کمتر شده بود. میزان بیان عوامل رگ زایی (CD31 و CD34) نیز در تمامی گروه های پیوندی به خصوص در تخمدان های دو گروه VTG و nVTG به گروه کنترل غیر پیوندی نزدیک تر شده بود.

از مطالعه حاضر می توان نتیجه گرفت که ترکیب ضدیخ های EG + DMSO و سوکروز، نسبت به سایر ترکیبات، برای حفظ فولیکول ها به خصوص در مراحل ابتدایی، مناسبتر است و استفاده از آن می تواند عملکرد نسبی تخمدان را پس از انجماد و پیوند به خودی به همراه داشته باشد.



کلیدواژگان: انجماد شیشه ای، بافت تخمدان، ترکیبات ضدیخ، پیوند به خودی، فراساختار فولیکول اولیه، گنادکتومی

 
 
Title: Study of ultrastructure and follicular maturation, angiogenic and apoptotic genes expression of rat ovarian tissue after vitrification and autotransplantation

Abstract:

The aim of this study was to determine a suitable cryoprotectant combination for whole rat ovarian vitrification and evaluate hormonal changes, the ultrastructure of the initial follicle, and follicle maturational, angiogenic and apoptotic gene expression of vitrified ovary following autotransplantation.
In the first part of this study we sought to determine the suitable cryoprotectant combination. Wistar rat ovaries were randomly divided into 13 groups as follows: control (nonvitrified); VI and TI (EG + DMSO); VII and TII (EG + PROH); VIII and TIII (DMSO + PROH); VIV and TIV (EG + DMSO + 0.25 mol/l sucrose); VV and TV (EG + PROH + 0.25 mol/l sucrose); and VVI and TVI (EG + PROH + 0.25 mol/l sucrose). Groups were evaluated by standard histology techniques, EM and immunohistochemistry.
In the second part of this study we investigated the effects of ovarian autotransplantation by using the appropriate previously determined cryoprotectant combination. The six groups of rat ovaries were divided as follows: control (nonvitrified nontransplanted); nVTnG (nonvitrified transplanted nongonadectomized); VTnG (vitrified transplanted nongonadectomized); nVTG (nonvitrified transplanted gonadectomized); VTG (vitrified transplanted gonadectomized); and BLG (bilateral gonadectomized). These groups were evaluated by standard histology techniques, EM and immunohistochemistery. Expressions of follicle maturational, angiogenic and apoptotic genes were studied by Real-time PCR. The levels of gonadotropins (LH, FSH) and steroid hormones (estradiol, progesterone and testosterone) in blood serum were compared to the control and BLG groups.
The results showed that vitrified groups had lower numbers of intact follicles and higher numbers of apoptotic follicles compared to the control group. Between vitrified groups, the VIV group had the best survival rate, particularly for initial follicles. This group had a lower incidence of apoptosis. Ultrastructural changes of the last group were considerable compared to the control but this result did not differ compared to the sucrose-free (VI) group.
Vitrified and nonvitrified ovarian autotransplantation caused restoration of the hormone cycle and ovarian function; these results approximated the controls in both of the nVTG and VTG groups. In the recent groups, the percentage of follicular maturation and ultrastructure of transplanted ovaries were in better condition. In these groups, however, the incidence of apoptosis in primordial and antral follicles was higher, whereas the incidence of apoptosis in primary and preantral follicles was lower than the VTnG and nVTnG groups. Also the rate of expressions of angiogenic factors (CD31 and CD34) in all of the transplanted groups, particularly in the nVTG and VTG groups, were comparable with the control.
The results of this study showed that a combination of EG + DMSO and sucrose was more suited for follicular preservation, particularly at the initial stage could relatively restore ovarian function after vitrification and autotransplantation.



Keyword(s): Vitrification, Ovarian tissue, Cryoprotectant combinations, Autotransplantation, Ultrastructure of initial follicle, Gonadectomy